陈卓，黄丹，于华，唐姣，罗雪，毛祥，唐平
(四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000)
功能菌对泡菜风味物质形成的影响
陈卓，黄丹*，于华，唐姣，罗雪，毛祥，唐平
(四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡 643000)
以分离于自然发酵泡菜中的植物乳杆菌和酵母菌作为功能菌强化发酵制作泡菜；并研究功能菌对泡菜风味物质形成的影响。采用高效液相色谱法、顶空固相微萃取-气质联用技术对发酵泡菜中有机酸和挥发性香气成分进行分析检测，研究酵母菌不同接种量对泡菜风味物质的影响。结果表明：酵母菌接种量为0.5%时，泡菜中风味物质较多；自然发酵泡菜风味与人工接种功能菌发酵泡菜风味差异较大，不同发酵时间和接种量的泡菜风味物质的种类和含量也有所差异，发酵过程中共检出6种有机酸和41种挥发性成分，其中有机酸中草酸、乳酸含量较高，挥发性成分中酯类、醇类、酚类以及二甲基硫化物相对含量较高，是白萝卜泡菜的特征风味成分。
泡菜；功能菌；有机酸；挥发性成分
泡菜是我国一种传统而大众化的发酵食品，具有典型代表性，历史悠久，工艺传承千年，为中华传统生物食品之瑰宝。其发酵原理是在自然条件下微生物利用原料中的营养物质进行发酵，形成泡菜特殊的色泽和风味[1]。其具有鲜酸可口、质地脆嫩、风味独特、营养丰富等特点，经常食用可达到防病治病、保健和延年益寿的功效，因此深受广大消费者喜爱。目前我国泡菜的生产主要采用自然发酵和人工接种发酵2种方式[2]。自然发酵虽然口味醇厚，但其生产周期较长、产品质量不稳定、食用期较短，且易受腐败菌污染等问题，不能适应工业化生产的要求[3]，所以选择合适的发酵剂进行人工接种，使泡菜产品风味与自然发酵泡菜的产品风味相近，实现大规模生产，具有较高的经济价值和市场前景。
泡菜的风味物质除原料本身外，最主要来自微生物发酵所产生的代谢产物。国内外对泡菜风味做了多方面的研究，Soon-Mi Shim等[4]研究了韩国泡菜低温储藏过程中有机酸的变化，发现乳酸和乙酸是主要的有机酸，苹果酸在最初的储藏阶段迅速减少。刘春燕等[5]研究了不同乳酸菌接种对发酵泡菜风味的影响，发现不同乳酸菌发酵的泡菜挥发性成分及有机酸的种类差异不显着。徐丹萍等[6]对泡菜自然发酵过程中品质及挥发性成分进行了分析，结果得到硫氰酸甲酯、(E)-丁酸-4-己烯酯、乙酸己酯、叶醇、正己醇、β-蒎烯、二甲基二硫和二甲基三硫对泡菜风味形成影响较大。本文在前期研究的基础上，采用高效液相色谱法、顶空固相微萃取-气质联用技术对泡菜中的风味成分进行定性定量分析研究，比较自然发酵和人工接种功能菌发酵的泡菜的风味成分，确定泡菜中的主体风味成分，既可为功能菌发酵泡菜取代自然发酵泡菜提供理论依据，又可为提高泡菜产品质量打下坚实基础，为泡菜工业化生产起指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原材料
新鲜白萝卜：自贡市沃尔玛超市购买；植物乳杆菌(L.plantarum)、维克汉姆酵母(Wickham yeast)：四川理工学院生物工程学院实验室提供，分离于自然发酵泡菜中。
氢氧化钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二铵、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸等：以上药品均为分析纯；琥珀酸、草酸、苹果酸、乙酸：以上药品均为色谱纯。
1.1.2 培养基
MRS培养基用于乳酸菌的活化、培养和计数；YPD培养基用于酵母菌的活化、培养。
1.1.3 仪器与设备
土陶坛；LRH-250恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；洁净工作台 苏州净化仪器有限公司；立式自动压力蒸汽灭菌锅 致微仪器有限公司；BH200生物显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；CP214电子天平 奥豪斯仪器有限公司；0.45 μm水系微孔滤膜 上海医药工业研究院；数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司；高效液相色谱仪、气相色谱-质谱联用仪 美国 Agilent公司；固相微萃取装置：包括手柄、导向杆、85 μm CAR-PDMS萃取纤维头 美国Supelco公司。
1.2 试验方法
1.2.1 种子发酵剂
分别将实验室保藏的植物乳杆菌和维克汉姆酵母在相应的MRS平板培养基、YPD平板培养基上活化，再取1环活化的菌种，接种于相应的平板培养基上培养至对数后期，用生理盐水洗下，计数，以此作为接种白萝卜的种子发酵剂。
1.2.2 泡菜制备
1.2.2.1 自然发酵泡菜
新鲜萝卜→清洗→切片→分装→注水→8%食盐→厌氧发酵6天。设为空白组。
1.2.2.2 功能菌强化发酵泡菜
新鲜萝卜→清洗→切片→分装→注水→8%食盐→接功能菌(乳酸菌：0.375%接种量；酵母菌：不同水平0，0.25%，0.5%，0.75%接种量)→厌氧发酵6天。设为实验组。乳酸菌以0.375%的接种量是根据前期实验泡菜液中的总酸和降解亚硝酸盐的能力确定的。
1.2.3 有机酸的分析
1.2.3.1 样品前处理
取10 mL泡菜液于100 mL容量瓶中，加入2 mL亚铁氰化钾溶液(10.6%)和2 mL硫酸锌溶液(30%)，摇匀后，用超纯水定容，静置30 min后，先用双层滤纸过滤，再用0.45 μL微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析[7,8]。
1.2.3.2 液相色谱条件
色谱柱：Gemini 5u C18110A柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以5%色谱甲醇-95% 0.5%(NH4)2HPO4(用H3PO4调节pH至2.7)为流动相，流速为0.5 mL/min，柱温35 ℃，柱压75 bar，紫外检测波长210 nm，进样量10 μL。
1.2.3.3 分析步骤
a.标准曲线制作
准确称量各有机酸标准品1 g(或1 mL)以超纯水溶解并定容至100 mL，即为10.0 mg/mL标准贮藏液。
分别将贮藏液用超纯水以5，10，15，20倍稀释，进样检测，分别测定不同标准品出峰时间及其不同浓度所对应的峰面积，制作标准曲线。
b.样品测定
各待测样品处理后上机检测，记录数据，与标准曲线对照定量计算。
1.2.4 挥发性风味物质的分析
1.2.4.1 固相微萃取萃取条件
将85 μm萃取头于250 ℃下老化30 min，直至无干扰峰出现。取2 g泡菜碾碎，添加4 mL泡菜汁加入顶空进样瓶中，并加入2 g NaCl和搅拌子，50 ℃平衡15 min，将萃取头插入瓶中，推出纤维头，使之与液面保持1 cm的距离，保温萃取30 min，搅拌速度为200 r/min，随后抽回纤维头，拔出，再插入气相色谱进样口230 ℃解吸3 min。
1.2.4.2 气相色谱-质谱条件[9]
色谱条件：进样口温度230 ℃；柱流速为恒定流量1 mL/min；不分流进样模式：程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升到100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升到230 ℃，保持7 min。
质谱条件：接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；数据采集模式为全扫描；电子能量70 eV；质量扫描范围33～450 amu。
定性方法：将得到的每个样品的质谱数据与NIST Library对照相匹配，对匹配度大于80(最大为100)的鉴定结果予以确认。
定量方法：利用图谱库工作站数据处理系统按峰面积归一化法进行定量分析，求得各样品中挥发性风味物质成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 泡菜的风味成分
食品的风味是食品中许多不同种类、不同数量的风味物质对人体感官的综合效果[10]。影响泡菜风味的成分包括挥发性成分和不挥发性成分，挥发性成分影响泡菜的香味，即人的嗅觉评价，不挥发性成分影响泡菜的口味，即人的味觉评价。
2.2 泡菜中有机酸的分析
2.2.1 有机酸标准曲线
按1.2.3方法配制7种有机酸标准品溶液，经过HPLC检测，得到对应的图谱，见图1。通过结合文献和单标结果综合分析，得出峰1为草酸，峰2为酒石酸，峰3为苹果酸，峰4为乳酸，峰5为冰乙酸，峰6为柠檬酸，峰7为琥珀酸。以各标准品浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，各标准品的保留时间、回归方程、相关系数见表1。
图1 有机酸标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC of organic acid standard sample
有机酸保留时间(min)回归方程相关系数草酸5.786y=0.0217x-11.0030.9998酒石酸6.312y=0.0686x-5.09780.9997苹果酸7.343y=0.1461x-4.80920.9997乳酸8.579y=0.2157x+0.75190.9999冰乙酸9.082y=0.1626x+48.7430.9929柠檬酸10.070y=0.106x+1.95370.9991琥珀酸11.710y=0.2579x-8.54290.9995
注：y为峰面积，x为各有机酸浓度(mg/dL)。
2.2.2 泡菜中有机酸含量分析
在相同测定条件下，通过高效液相色谱法对各发酵泡菜中的有机酸进行检测，结果与标准品的保留时间相比较，确定其对应的各种有机酸，并根据标准曲线计算有机酸的含量，结果见表2。
表2 发酵泡菜中有机酸的含量Table 2 Content of organic acids in fermented pickles
注：“-”表示未检测出此物质。
泡菜的不挥发性成分主要包括有机酸和氨基酸等。其品质主要取决于各种有机酸、氨基酸和各种微量元素的含量，其中有机酸是影响泡菜风味和营养的主要物质，在发酵泡菜中酒石酸未检测出，其原因可能是含量过低，或者是被其他物质干扰所致，柠檬酸、苹果酸含量比自然发酵泡菜中相对较低，其中柠檬酸具有爽快的酸味，苹果酸具有温和爽快的酸味，略带苦味，而稍有涩感，酸爽尖利的乳酸则含量较高，导致了发酵泡菜的酸味尖利，柔和感不高，琥珀酸是一种具有鲜味的有机酸，其钠盐具有独特的鲜爽味，在泡菜中食盐的钠离子作用下呈现鲜味，人工接种发酵与自然发酵中其含量差异不大，可以推测出在鲜味上较为相似。草酸为泡菜中含量最高的有机酸，自然发酵与人工接种发酵泡菜中的含量差异不大。
2.3 泡菜中挥发性风味物质含量分析
将发酵泡菜处理后通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对其挥发性风味成分进行检测，并对GC/MS检测到的结果进行分析，得到不同泡菜样品中主要挥发性成分及相对含量。从5种泡菜样品中共测定出41种挥发性风味成分，其中酸类物质3种、酯类物质6种、醇类物质10种、二甲基硫化物2种、醚类物质3种、噻吩类物质1种、醛类物质1种、呋喃类物质1种、酚类物质6种、酮类物质1种、烃类物质3种、其他物质4种，结果见表3。
表3 白萝卜泡菜挥发性风味成分含量Table 3 Content of volatile flavor components in white radish pickles
续 表
注：“-”表示未检测出此物质。
泡菜的香气成分对品质的评价起着重要的作用。泡菜中的香气成分主要来源于原料与发酵过程，由于发酵工艺不同其产品香气成分及感官鉴定结果截然不同。在上述泡菜样品中，酵母菌接种量为0.5%时，风味物质的种类最多，含量也相对较高，检测到的挥发性风味物质主要有酯类、醇类、酚类、醚类、烃类等，其中检测到的硫化物主要是二甲基二硫、二甲基三硫，且含量相对较高，其阈值很低，低含量就能产生很浓的香味，是泡菜具有独特风味的主要原因。醇类是常见的挥发性风味物质，泡菜中的醇类可能跟微生物发酵相关。白萝卜泡菜中醇类占挥发性成分的比例最高，其中主要以乙醇为主体，人工接种功能菌中，乙醇相对含量低于自然发酵中的乙醇相对含量。酯类是具有香气的挥发性液体，是构成泡菜特殊风味的重要组成部分，在上述泡菜样品中，酯类在挥发性成分中所占的比例仅次于醇类，以1-异硫代氰酸丁酯、乙酸乙酯为主，人工接种发酵泡菜中酯类种类及含量明显高于自然发酵泡菜，其原因可能是接种后乳酸菌和酵母菌在发酵过程中产生的代谢产物所致。酚类也是该泡菜样品的主要成分，影响着泡菜的风味与营养。2-甲基四氢噻吩、2,3-二氢苯并呋喃均未在自然发酵泡菜中检测出，但在人工接种发酵泡菜中检测出，且相对含量较高。
总体而言，人工接种发酵泡菜比自然发酵泡菜中挥发性风味物质的种类更多，相对含量更高，其风味物质主要来源于原料本身和微生物在发酵过程中产生的代谢产物。
3 结论
本研究是以高降解亚硝酸盐乳酸菌和高产酯类酵母菌为人工接种发酵泡菜的发酵剂，在泡菜制作过程中添加不同的接种量制作泡菜，采用高效液相色谱法、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对泡菜中的有机酸和挥发性风味物质进行测定分析，结果显示酵母菌接种量为0.5%时，风味物质种类及含量相对较多，有6种有机酸和41种挥发性风味物质被检测出来，其中有机酸中草酸、乳酸含量较高，挥发性成分中乙酸乙酯、1-异硫代氰酸丁酯、乙醇、二甲基二硫、二甲基三硫相对含量较高，是构成泡菜风味的主要组成部分，与自然发酵泡菜相比，人工接种发酵泡菜中风味物质的种类更多，相对含量更高，无论是从感官评定还是含量分析中均能得出人工接种发酵泡菜优于自然发酵泡菜，此研究为接种功能菌对泡菜风味的影响奠定了基础，对在工业上提升泡菜发酵工艺具有重要的意义。
[1]徐丹萍，蒲彪，卓志航，等.传统泡菜中乳酸菌对风味的影响[J].食品与发酵工业，2014,40(2)：170-173.
[2]刘洪.自然发酵与人工接种泡菜发酵过程中品质变化规律的动态研究[D].成都:西华大学，2012.
[3]朱文娴，周相玲，张惠，等.人工接种泡菜的风味研究[J].食品工业科技，2007(11)：108-110.
[4]Shim Mi S，Kim J Y，Lee S M，et al. Profiling of fermentative metabolites in kimchi: volatile and non-volatile organic acids[J].Korean Soc Appl Biol Chem，2012(55):463-469.
[5]刘春燕，戴明福，夏姣，等.不同乳酸菌接种发酵泡菜风味的研究[J].食品工业科技，2015(6)：154-158.
[6]徐丹萍，蒲彪，罗松明，等.泡菜自然发酵过程中品质及挥发性成分分析[J].食品工业科技，2015(13)：288-294.
[7]张丽娟，许伟，许泓瑜，等.恒顺香醋固态发酵过程中有机酸的变化分析[J].中国调味品,2009,34(2)：106-109.
[8]余永建，邓晓阳，陆震鸣，等.高效液相色谱法定量分析固态发酵食醋中有机酸的方法优化[J].食品科学，2014,35(4):55-59.
[9]Xiao Zuobing,Dai Shuiping,Niu Yunwei, et al. Discrimination of Chinese vinegar based on headspace solid-phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry of volatile compounds and multivariate analysis[J].Journal of Food Science,2011,76(8):1125-1135.
[10]李亚丹.镇江香醋生产过程中风味物质和功能因子的变化规律[D].无锡:江南大学，2008.
EffectofFunctionalBacteriaontheFormationofFlavorSubstancesinPickles
CHEN Zhuo, HUANG Dan*, YU Hua, TANG Jiao, LUO Xue, MAO Xiang, TANG Ping
(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China)
UseLactobacillusplantarumand yeast isolated from natural fermented pickles as functional bacteria to strengthen the production of pickles' fermentation, and the effect of functional bacteria on the formation of flavor substances in pickles is studied.The organic acids and volatiles in fermented pickles are detected and analyzed by high performance liquid chromatography with headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry.The effects of different inoculation amount of yeast on the flavor compounds of pickled are also studied.The results show that when the inoculation amount of yeast is 0.5%, the flavor substances of the pickles are more, the natural fermented pickles are very different from artificial inoculated functional bacteria fermented pickles in flavor. The types and levels of pickles' flavor substances in different fermentation time and inoculation amount are also different. And 6 kinds of organic acids and 41 kinds of volatile components are detected in the fermentation process, the content of oxalic acid and lactic acid in organic acid is high, the relative content of esters, alcohols, phenols and dimethylsulfides in volatile components is higher. They are the characteristic flavor ingredients of the white radish pickles.
pickles；functional bacteria；organic acid；volatile components
TS255.54
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.014
1000-9973(2017)12-0066-05
2017-06-15 *通讯作者
四川省重点实验室基金项目(2015GTY010)；四川省富顺县科技创新基金项目(201512)
陈卓(1991-)，男，山东济宁人，硕士，主要从事固态酿造功能微生物方面的研究；
黄丹(1968-)，女，教授，主要从事微生物及应用方面的研究。
