倪润洲 ，肖明兵，江 枫，李小彦 ，钮晓音

（1南通大学附属医院消化内科，江苏 226001；2上海交通大学医学院，上海免疫学研究所）

胆胃宁是由经典方大柴胡汤加减而成，在临床上对胆汁反流性胃炎所致的胃黏膜病变有较好的疗效。我们在先前的实验中,证实胆胃宁对乙醇性胃黏膜损伤具有良好的修复作用。在胃黏膜损伤病变中，局部组织中炎症因子改变起到重要的致病作用。目前在致炎因子的研究中，Th17型细胞因子是最新发现的一类前炎症因子，包括IL-17、IL-21、IL-6等，它们在炎症性疾病中起到关键的致病作用。本研究将通过胆胃宁对胃粘膜Th17型细胞因子浓度水平的诱导变化,阐明胆胃宁对胃粘膜炎症的清除保护效应机制，进一步加深中药治病机理的研究，为中药现代化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：BALB/c小鼠，雌性，8周龄，共20只，由南通大学动物中心提供，许可证编号：SYXK(苏)20002—002。(2)药物与试剂 :胆胃宁由炒柴胡 10g、炒黄芩 10g、炒枳壳 10g、法半夏 10g、制军8g、杭白芍 15g、广郁金 12g、广木香 10g(后下)、粉甘草3g、加水煎至100mL，由南通市中医院制剂室提供。IL-17、IL-21、IL-6细胞因子的检测抗体和标准品（R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及标本处理：（1）将 20只 BALB/c小鼠随机分成生理盐水组和胆胃宁组，每组10只。小鼠禁食24h、禁水2h后，以无水乙醇5mL/kg体重灌胃制作急性胃黏膜损伤模型。2h后生理盐水组以15mL/kg生理盐水灌胃。胆胃宁组以15mL/kg剂量灌胃治疗，每隔3h后按以上方法重复灌胃，24h后用戊巴比妥麻醉剖腹取全胃。（2）小鼠麻醉后剖腹取胃，在胃相同部位切取组织块0.5 cm×1.0 cm，称重后制备组织匀浆，取上清液置-80℃保存。

1.2.2 ELISA 检测：（1）包被：用 PBS 稀释包被抗体monoclonal anti-mouse IL-17/IL～21/IL-6 antibody(capture antibody)，以100μL/孔加入 96孔酶标板，4℃过夜。（2）封闭：弃去包被抗体，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗涤3次，加入封闭液（PBS-1%BSA）200μL/孔，37℃孵育 1h。（3） 弃去封闭液，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20 洗涤 1 次，加入待测上清样品和倍比稀释的标准品 50～100μL/孔，37℃孵育 1h。（4） 弃去样品和标准品，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗涤3次，加入稀释好的检测抗体biotinylated anti-mouse IL-17/IL～21/IL-6 antibody（detect antibody）100μL 孔，37℃孵育 1h；（5）弃去检测抗体，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20 洗涤 3 次，加入 Streptavidin-HRP 100μL/孔，37℃避光孵育 1h。（6） 弃 去 Streptavidin-HRP，300μL/孔 PBS-0.05%Tween20洗涤3次，加入底物100μL/孔，37℃避光孵育 1h；（7）加入终止液：100μL/孔；（8）读板：酶标仪450nm波长处测OD值；（9）根据标准曲线计算样本细胞因子浓度。

1.3 统计学处理 计量数据采用均数±标准差表示，组间差异性比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在乙醇所致的急性胃黏膜损伤模型中，胆胃宁能够明显下调胃粘膜组织中Th17型细胞因子IL-17、IL-21、IL-6的浓度水平（图 1），其下调改变与胃粘膜保护作用相一致。胃黏膜中IL-6的浓度在胆胃宁组中为 6.30±2.15pg/mL，生理盐水组为 10.27±1.80pg/mL；IL-21 的浓度在胆胃宁组中为 2.76±0.51pg/mL，生理盐水组为 9.17±3.64pg/mL；IL-17 的浓度在胆胃宁组中为 14.52±3.30pg/mL，生理盐水组为 30.49±3.56pg/mL。IL-21 和 IL-17 浓度的改变有统计学意义（P＜0.01）。其中炎症因子IL-17浓度改变最为明显，说明胆胃宁对胃黏膜中炎症因子具有明确的下调保护作用。

图1 胆胃宁下调胃粘膜Th17型细胞因子的浓度水平

3 讨 论

胆胃宁是由经典方大柴胡汤加减而成，组方包括炒柴胡,炒黄芩,炒枳壳,法半夏,制军,杭白芍,广郁金,广木香,川厚朴,炒白术,粉甘草。先前的182例临床研究显示它对胆汁反流性胃炎有显著疗效[1]。我们曾在乙醇所致的胃粘膜急性损伤动物模型中发现，胆胃宁组大鼠胃黏膜损伤指数均显著低于模型组，胆胃宁组胃黏膜损伤轻于雷尼替丁及硫糖铝组。实验显示，胆胃宁能提高大鼠胃黏膜内前列腺素PGE水平，降低丙二醛MDA含量。因此胆胃宁能够通过降低脂质过氧化，提高抗氧化活力和促进PGE合成来促使急性胃黏膜损伤的修复[2]。

Th17型细胞因子是一类最新发现的前炎症因子，包括IL-17、IL-21、IL-6等，它们是由Th17细胞产生和分泌的，在炎症性疾病中起到关键的致病作用[3-4]。Th17细胞是一群不同于Th1、Th2的CD4效应T细胞，且在分化途径和免疫调节方面，与调节性T细胞（Treg）相互制约维持平衡[5]。最新研究显示，在胃粘膜的急慢性炎症中，以Th17型细胞因子为主的前炎症因子在疾病的进展中起到重要的促进作用[6-7]。

中药对免疫系统的作用影响一直是研究的热点，但是在胃粘膜保护机制方面，还很少有人涉及。本实验证明胆胃宁能够通过对胃粘膜Th17型细胞因子浓度水平的诱导和改变，发挥对胃粘膜炎症的清除保护效应，明确了胆胃宁可通过免疫学机制下调胃黏膜炎症反应。

[1]顾庆华，邵荣世，罗佩英，等.胆胃宁颗粒剂治疗胆汁反流性胃炎的临床研究[J].中医药学刊，2004，22（11）：2040-2042.

[2]高秀华，肖明兵，顾庆华，等.胆胃宁对乙醇性胃黏膜损伤的治疗作用[J].江苏医药，2008，34（11）：1138-1140.

[3]Singh R,Aggarwal A,Misra R.Th1/Th17 cytokine profiles in patients with reactive arthritis/undifferentiated spondyloarthropathy[J].J Rheumatol，2007,34(11):2285-2290.

[4]Boissier MC,Assier E,Falgarone G,et al.Shifting the imbalance from Th1/Th2 to Th17/treg:the changing rheumatoid arthritis paradigm[J].Joint Bone Spine,2008,75(4):373-375.

[5]Di Carlo E,Comes A,Orengo AM,et al.IL-21 induces tumor rejection by specific CTL and IFN-gamma-dependent CXC chemokines in syngeneic mice[J].J Immunol,2004,172(3):1540-1547.

[6]Pandolfi F,Cianci R,Pagliari D,et al.Cellular mediators of inflammation:tregs and TH17 cells in gastrointestinal diseases[J].Mediators Inflamm.2009,2009:132028.

[7]Blaschitz C,Raffatellu M.Th17 cytokines and the gut mucosal barrier[J].J Clin Immunol,2010,30(2):196-203.