[中图分类号]R631 [文献标志码]A [DOI] 10.19767/j.cnki.32-1412.2025.05.002
Screening of Sepsis-Associated Circular RNAs and Construction of Competing Endogenous RNA Networks
GUANYuwen，LIANGGuiwen，HUANG Zhongwei，QI Lei， JIANGHaiyan （Departmentof EmergencyMedicine，Afliated Hospital of Nantong University，Jiangsu 226001）
[Abstract]Objective：To explore the regulatoryroleof non-coding RNAs（ncRNAs），particularlylong non-coding RNAs （lncRNAs），inthepathological progressionofsepsis，toidentifynvelbiomarkersforarlydiagnosis，andtoiscover potential therapeutic targets for intervening in immune imbalance.Methods：Peripheral blood samples frompatients with sepsisand healthy individualswerecollected.Wesystematicallyanalyzed the specific expression profilesof lncRNAs in sepsis through ceRNA microarray technology. We investigatedtheregulatory mechanisms oflncRNAs insepsis byintegating theinteractionnetworksof microRNAs（miRNAs）and circularRNAs（circRNAs）.Results：The studyrevealed that IncRNAsexhibitedsignificant diferential expresion insepsis，including248up-regulatedand26down-regulated lncRNAs withdiferential expression.CombiningGOenrichmentanalysisandKEGGpathwayclasificationanalysis，theesults indicatedthat lncRNAsmightparticipate intheregulationof inflammatorystormsand immunosuppressonthrough the ceRNA mechanism.Certain IncRNAs were closely asociated with immune imbalance in sepsis，demonstrating potential as biomarkers or therapeutic targets.Conclusion：lncRNAsplayacriticalrole inthepathological progresionofsepsis.Their specific expresionprofilesprovidenovelcandidate biomarkers forearlydiagnosisof sepsisandoferpotentialtargets for therapeutic strategies aimed at modulating immune dysregulation.
[Keywords] sepsis; non-coding RNA;biomarker
脓毒症（Sepsis）是由于宿主对感染的反应失调，引起危及生命的器官功能障碍I。根据《拯救脓毒症运动》（Surviving Sepsis Campaign，SSC）最新指南，脓毒症需早期诊断和治疗以改善预后并降低死亡率2。然而，自前仍缺乏早期识别脓毒症的生物标志物及针对性治疗手段，因此，深入探索脓毒症的发病机制至关重要。脓毒症可诱发心血管功能障碍、急性肺损伤（acute lung injury，ALI）急性肾损伤（acute kidneyinjury，AKI）等器官功能障碍，导致高死亡率3，亟需进一步研究脓毒症诱发器官功能障碍的病理生理机制。基因调控网络研究长期集中于蛋白质编码基因，然而人类基因组中约 90% 非编码序列可转录为非编码RNA（ncRNA），ncRNA在多种生物过程中发挥关键调控作用。ncRNA可分为短链ncRNA（ lt;200 个核苷酸）和长链ncRNA（IncRNA， gt;200 个核苷酸）。短链ncRNA以微小RNA（miRNA）为主，miRNA参与脓毒症等多种疾病[8。但对占ncRNA大部分的IncRNA研究仍处于起步阶段。
研究发现，lncRNA对脓毒症器官功能损伤有重要作用，同时lncRNA通过调控核因子 -κB （NF-kF）、NLRP3等信号通路影响炎症因子释放。尽管lncRNA不编码蛋白质，但在基因表达的调控中发挥重要作用，可能构成脓毒症关键的内源竞争RNA（competingendogenousRNA，ceRNA）调控网络。根据与邻近蛋白质编码基因组的位置关系，lncRNA可分为基因间型、内含子型、双向型、正义型、反义型和增强子型lncRNA]。按调控模式，IncRNA可分为顺式作用（影响邻近基因的表达和/或染色质状态）和反式作用（在细胞内执行多种功能）两类[2]。lncRNA通过直接结合DNA、RNA及蛋白质参与转录和转录后调控[13]。在靶基因的转录调控中，lncRNA可作为支架或诱饵抑制或激活基因[o]。此外，lncRNA还能增强基因转录，并通过改变mRNA剪接实现共转录调控。lncRNA可影响mRNA稳定性，并通过结合核糖体或mRNA调控翻译过程[14。lncRNA还能作为miRNA海绵，间接解除miRNA对靶mRNA的抑制[15]。这些证据表明，IncRNA是一类庞大、多样且重要的转录本，通过多种机制参与基因表达调控。本文旨在为lncRNA在脓毒症中的作用机制提供新的分子视角，为脓毒症的早期诊治提供新的方向。
1资料与方法
1.1研究对象选取2024年5月一9月在我院重症监护室确诊的3例脓毒症患者为研究对象，按指南进行规范治疗。纳入标准：（1）年龄：18～70岁；（2）符合2016年美国危重病医学会（SocietyofCriticalCareMedicine，SCCM）联合欧洲危重病医学会（Eu-ropeanSocietyofIntensiveCareMedicine，ESICM）有关脓毒症诊断标准。排除标准：（1）既往有肿瘤、血液系统疾病、免疫风湿性疾病史者；（2）合并重症急性胰腺炎；（3）2周内使用过糖皮质激素。以3例健康者作为对照，采样前后2周未患任何疾病。本研究方案获得医院伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。
1.2 实验室检测
1.2.1RNA抽提：采集研究对象静脉血 2～5mL 于抗凝管，快速转移至RNase-free冻存管中， -80∘C 冰箱保存。采用PAXgeneTM血液RNA试剂盒（Cat#762174，Qiagen，Germany），按照厂商提供的标准操作流程抽提样品总RNA，经生物分析仪2100（AgilentTechnologies，US）电泳质检合格后备用。
1.2.2RNA放大和标记：采用表达谱芯片配套试剂盒（Cat.#5190-2305，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US）对样品总RNA进行放大和标记，并用RNeasymini kit（Cat.#74106，QIAGEN，GmBH，Germany）纯化标记后的cRNA。
1.2.3芯片杂交：采用表达谱芯片配套试剂盒（Cat.#5188-5242，AgilentTechnologies，US），在滚动杂交炉（Cat.#G2545A，Agilent Technologies，US）中 65∘C， 10r/min 滚动杂交 17h ，杂交cRNA上样量 1.65μg 并在洗缸（Cat.#121，Thermo Shandon，US）中洗片。
1.2.4芯片扫描：完成杂交的芯片采用芯片扫描仪（Cat.#G2565CA，Agilent Technologies，US）扫描，软件设置染料通道为绿色，扫描分辨率365CA。用特征提取软件10.7（Agilent Technologies，US）读取数据，最后采用R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为分位数Quantile。
1.3差异表达基因筛选在初步差异分析的基础上，我们进行补充分析以提升结果的稳健性。通过主成分分析剔除个体差异过大的离群样本，以降低组内异质性。调整样本分组策略，在差异基因筛选阶段，同步采用差异倍数阈值，引入配对 χt 检验计算 P 值，利用 P 值与 log2FC 的组合标准进行双重筛选。1.4差异基因图形分析由于差异基因筛选条件的改变，所筛选出的差异基因也会有所变化。可对新筛选的差异基因进行散点图、火山图、热图分析。由于样本分组信息改变，需要更新样本相关性分布图时，可进行主成份分析、样本相关性分析、样本聚类分析。
1.5差异基因的基因功能分析（Gene Ontology，GO）、信号通路分析（pathway）GO富集分析采取luster-Profiler软件包，挑选的标准是落在某个 
上差异的基因数目 ⩾2，Plt;0.05 ，图中 
按照富集因子的值从大到小降序排列，取前30个结果。富集因子定义 Σ=Σ （某个 term 中的差异基因数目/总的差异基因数目）八数据库 term 中总的基因数目/数据库中总的基因数目）。由于差异基因筛选条件的改变，选出的差异基因也会有所变化。采用DAVID6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对差异表达基因进行KEGG功能富集与GO功能富集分析。
1.6测序数据质量控制由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列，严重影响后续组装的质量。为保证生物信息分析的准确性，需对原始测序数据进行过滤，以得到高质量的测序数据。具体步骤：（1）修剪序列末端（5端和3端）低质量（质量值小于20）的碱基；（2）使用Cutadapt软件去除含N比率超过 10% 的碱基序列。
2结果
2.1差异表达基因筛选本研究通过ceRNA芯片技术对脓毒症患者血液样本进行全转录组分析，经过严格的数据标准化处理和差异表达分析，共发现274个差异表达的lncRNA，包括248个上调和26个下调IncRNA。为直观展示这些差异表达基因的特征，分别采用散点图展示基因表达量分布，火山图呈现差异表达基因的统计学显著性，热图显现各组样本间的表达模式差异。见图1和图2。
红色：2倍上调基因；绿色：2倍下调基因。
左图，X轴：探针点在对照芯片中标准化后的信号值。Y轴：探针点在样品芯片中标准化后的信号值。落在图形中 y=x 直线（图上中位线）上的点代表这个探针点在两张芯片中信号值差异Fold Chang ：=1 ，落在图形中位线两侧45度线之外的点代表这个探针点在两张芯片中信号值差异Fold Changegt;2。右图，X轴：Log2（Fold Change），Y轴： -Log10（P 值）。X轴平行线 ：P 值 =0.05，Y 轴平行线：Fold Change ：=2 ；红色区域： P 值 lt;0.05 Fold Change ⩾2 的差异基因;绿色区域： P 值 lt;0.05 、Fold Change ⩽0.5 的差异基因。
图1lncRNA散点图和火山图
图2IncRNA热图
黄色：表示基因表达水平无变化；红色：2倍上调基因；绿色：2倍下调基因。
2.2IncRNA通过顺式机制调控脓毒症疾病的关键途径通过对脓毒症中具有顺式（cis）调控作用的lncRNA进行ceRNA芯片检测及GO富集分析，结果显示其显著富集的生物过程主要包括细胞过程、生物调控和代谢过程；细胞组分主要富集于细胞、细胞部分和细胞器；而分子功能则主要集中在结合和催化活性。提示脓毒症中IncRNA可能通过顺式调控机制广泛参与细胞基本生命活动、基因表达调控及代谢过程，并可能通过与蛋白质或核酸分子的结合或影响酶活性来发挥生物学功能，进而影响疾病的发生发展。见图3。
通过对脓毒症中具有顺式调控作用的lncRNA进行ceRNA芯片检测及GO富集分析，选取Top30的显著富集通路进行深人解析。结果显示，这些lncRNA参与调控多种生物过程，其中最显著的是参与蛋白激酶B信号传导调节和蛋白激酶B信号传导等关键通路。此外，磷酸酶结合等蛋白相互作用功能也发挥重要作用。表明脓毒症中IncRNA可能通过顺式调控机制广泛参与AKT等关键信号转导过程，并通过与磷酸酶等调控蛋白的相互作用，在疾病炎症反应和免疫细胞功能调控中扮演重要角色。见图4。
2.3对脓毒症中具有反式调控作用的lncRNA进行GO富集分析通过ceRNA芯片对脓毒症中具有反式（trans）调控作用的IncRNA进行GO富集分析，结果显示这些IncRNA在生物过程方面显著富集于细胞过程和代谢过程；在细胞组分方面主要分布于细胞、细胞部分和细胞器；而在分子功能方面则主要涉及结合和催化活性。表明脓毒症中具有反式调控作用的lncRNA可能通过参与细胞基本生命活动、调控代谢过程以及与蛋白质或核酸结合或发挥酶活性等方式，在疾病的发生发展中发挥重要作用。见图5。
通过对脓毒症中具有反式调控作用的lncRNA进行ceRNA芯片检测及GO富集分析，选取Top30显著富集通路进行深入解析。结果显示，这些lncR-NA主要参与调控多种生物过程，其中最为显著的是参与干扰素β产生的调节和干扰素β产生。在细胞组分方面，这些lncRNA显著富集于高尔基体膜内在成分等亚细胞结构。表明脓毒症中具有反式调控作用的lncRNA可能通过调节干扰素 β 等关键免疫因子的产生，并靶向高尔基体等细胞器，在宿主免疫应答和炎症反应调控中发挥重要作用。见图6。
2.4对脓毒症相关lncRNA的顺式靶基因进行KEGG通路分类分析基于ceRNA芯片对脓毒症相关lncRNA的顺式靶基因进行KEGG通路分类分析，结果显示这些靶基因主要参与以下六大功能模块：在细胞过程中显著富集于运输与分解代谢通路；在环境信息处理方面主要涉及信号转导过程；在遗传信息处理中主要参与翻译调控；在人类疾病方面与特定类型癌症相关通路存在显著关联；在代谢过程中主要调控脂质代谢；在机体系统方面则显著富集于免疫系统相关通路。这些发现揭示了脓毒症中LncR-NA可能通过顺式调控作用影响多个关键生物学通路，特别是免疫调节和代谢重编程过程，为深入理解脓毒症的发病机制提供了新的分子视角。见图7。
基于ceRNA芯片对脓毒症相关lncRNA的顺式靶基因进行KEGG通路富集分析，选取Top30显著富集的信号通路进行深人解析。研究发现，轴突导向和光传导等神经相关通路表现出显著富集特征。这些结果表明，在脓毒症病理过程中IncRNA可能通过顺式调控机制参与神经信号传导和感觉信息处理等生物学过程，提示神经系统调控可能在脓毒症的全身炎症反应中发挥重要作用，为探索脓毒症多器官功能障碍的分子机制提供了新的研究方向。见图8。
图8ceRNA芯片对脓毒症相关IncRNA的顺式靶基因进行KEGG通路分类分析TOP30
2.5ceRNA芯片对脓毒症相关lncRNA的反式靶基因进行KEGG通路分类分析基于ceRNA芯片对脓毒症相关IncRNA的反式靶基因进行KEGG通路分类分析，结果显示这些靶基因主要参与以下功能模块：在细胞过程中显著富集于运输与分解代谢通路；在环境信息处理方面主要参与信号转导过程；在遗传信息处中主要涉及蛋白质折叠、分选和降解；在人类疾病方面与特定类型癌症相关通路存在显著关联；在代谢过程中主要调控脂质代谢；在机体系统方面则显著富集于免疫系统相关通路。这些发现表明，脓毒症中IncRNA可能通过反式调控作用影响多个关键生物学过程，特别是免疫应答和代谢调控网络，为深人解析脓毒症的分子机制提供了新的理论依据。见图9。
通过对脓毒症相关IncRNA的反式靶基因进行KEGG通路富集分析，选取Top30显著富集的信号通路进行深入研究。结果显示，基础转录因子和糖基磷脂酰肌醇锚定生物合成等通路表现出显著富集特征。表明在脓毒症病理过程中IncRNA可能通过反式调控机制影响基因转录起始和蛋白质膜锚定修饰等关键生物学过程，为深入理解脓毒症中基因表达调控异常和细胞膜功能紊乱的分子机制提供了新的研究方向。见图10。
图10ceRNA芯片对脓毒症相关IncRNA的反式靶基因进行KEGG通路分类分析TOP30
3讨论
脓毒症作为一种由感染引发的全身性炎症反应综合征，其高死亡率主要归因于早期诊断困难及缺乏特异性治疗手段。脓毒症常伴随多器官功能障碍，包括心血管功能异常、急性肺损伤和急性肾损伤，是导致其高死亡率的重要原因[。深入解析脓毒症的病理生理过程对于优化临床治疗策略及开发新型疗法具有重要意义。
近年来ncRNA在脓毒症发病机制中的关键调控作用逐渐被揭示，为理解脓毒症的复杂病理生理过程提供了新的视角。其中，多项最新研究表明lncRNA通过调控多种生物学过程参与脓毒症器官功能障碍的发生发展[8。随着高通量测序和基因芯片技术的发展，越来越多的研究揭示了IncRNA在不同疾病中的表达模式，证实其在生理和病理条件下的差异表达可能参与脓毒症等疾病的发生[9。本研究通过ceRNA芯片技术，筛选出274个差异表达的lncRNA，包括248个上调和26个下调lncRNA，揭示IncRNA通过多维度调控ceRNA网络参与脓毒症病理生理过程，为生物标志物及潜在靶向治疗提供新思路。
有研究表明，IncRNA（如MALAT1、NEAT1）可通过调控 NF-κB NLRP3等炎症通路加剧或抑制免疫反应20。本研究中差异表达的IncRNA上调基因约占 90.5% ，说明炎症信号（如 NF-κB ）可能直接激活非编码RNA转录。通过构建ceRNA网络，发现hub基因的靶miRNA预测IncRNA主导“免疫模块”（调控干扰素信号和抗原呈递）2l。通过对差异表达的具有顺式调控作用的IncRNA以及具有反式调控作用的IncRNA进行GO富集分析，结果显示这些lncRNA广泛参与细胞基本生命活动、基因表达调控及代谢过程，并可能通过与蛋白质或核酸分子的结合或影响酶活性来发挥其生物学功能。差异表达的lncRNA可能通过顺式调控机制广泛参与AKT信号通路等关键细胞信号转导过程，并通过与磷酸酶等调控蛋白的相互作用，在疾病发生发展中产生影响；脓毒症中具有反式调控作用的IncRNA可能通过调节干扰素β等关键免疫因子的产生，并靶向高尔基体等细胞器，在宿主免疫应答和炎症反应调控中起到重要作用。KEGG分析揭示的PI3K-AKT通路富集值得深入探讨。本研究发现，顺式作用的lncRNA（如LNCAROD）邻近调控AKT1基因，而反式作用的IncRNA（如MALAT1）则通过结合转录因子（如STAT3）远程调控AKT表达。这种双重调控可能形成"快速响应-持续激活"的时序模式：顺式作用在感染初期快速启动AKT信号，反式作用则维持后期代谢重编程。这与脓毒症患者血糖动态变化（早期高血糖 $$ 后期低血糖）的临床观察高度一致。代谢紊乱与免疫失调的相互促进是脓毒症的核心特征[]。
lncRNA调控的GPI锚定生物合成异常（ P=4.6× 10-5 ）可能影响CD14等受体膜定位，导致LPS敏感性改变。这些发现将“免疫-代谢轴"理论从蛋白质层面扩展至RNA调控层面。“轴突导向”通路在lncRNA顺式靶标中的富集 P=7.3×10-6 是本研究的重要发现。差异基因如SLIT2、ROBO1原本参与神经元迁移，却在脓毒症中异常表达。近年研究表明，迷走神经通过 α7nAChR 受体参与神经元受体调控巨噬细胞功能22，我们的结果提示IncRNA可能介导这种“神经-免疫对话”，这为探索迷走神经刺激治疗脓毒症提供了分子靶点。我们在该研究的基础上，预实验结果显示靶向lncRNA肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）的反义寡核苷酸（antisense oligonu-cleotides，ASO）药物可改善脓毒症小鼠的生存率。与Seymour等提出的脓毒症分子分型（MARS分类）相比，本研究发现的ceRNA网络更倾向于内毒素型（以脂多糖反应为特征）和炎症型。特别值得注意的是，我们的PI3K-AKT调控模块与Hotchkiss提出的“免疫抑制学说”形成有趣互补：AKT信号过度激活可能导致免疫细胞“耗竭”，而不仅是功能抑制。这一发现可能为脓毒症分期治疗提供新思路一早期抑制AKT，后期增强其活性。
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